近大など、卵子に精製DNA溶液を注入することで人工細胞核の構築に成功

近畿大学(近大)と大阪大学(阪大)は9月12日、精子の代わりに精製したDNA溶液を生きたマウスの卵に注入することにより「人工細胞核」を構築することに成功したことを共同で発表した。

同成果は、近大生物理工学部/大学院生物理工学研究科の山縣一夫教授、同・米澤直央大学院生、慶應義塾大学医学部電子顕微鏡研究室の信藤知子技術員、東京工業大学科学技術創成研究院の小田春佳博士研究員(研究当時)、同・木村宏教授、阪大大学院生命機能研究科の平岡泰招へい教授、同・原口徳子特任教授らの共同研究チームによるもの。詳細は、細胞生物学に関する全般を扱う学術誌「Genes to Cells」に掲載された。

マウス卵子内に構築された人工細胞核の電子顕微鏡像。精製されたDNA溶液を用いて構築された人工細胞核(右)は、卵子由来の天然の細胞核(左)と形態が酷似していた(出所:NEWSCAST Webサイト)

細胞核の形成に関する先行研究の多くは、カエルの卵母細胞の抽出物が用いられており、細胞が生きたままの状態で核を観察できていなかったとする。それに対して研究チームは、先行研究でマウス受精卵内にDNAビーズを導入する方法で核様構造の再構築に成功。ヌクレオソーム構造や核膜・核膜孔構造を有しているほか、これまでに核構築に関わるとされる多彩な分子も通常の核と同様に存在していることを確認していた。

しかし、核と細胞質間の物質輸送能力は実現できていなかったとする。その原因として、DNAの量や長さ、DNAの注入タイミングなど、物理化学的因子のミスマッチが考えられたとする。そこで今回の研究では、細かい条件設定のしやすい精製DNA溶液を用いて検討を行うことにしたという。

マウス卵内でDNAから人工細胞核を作製するためには、卵子細胞質中にDNAを注入する必要があることから、マイクロインジェクション技術が用いられた。DNAはDNAビーズとしてではなくDNA溶液として注入し、核様構造を形成するために必要なDNAの長さ・濃度・時間の条件が検討された。その結果、少なくとも長さ48.5kbp(キロベースペア)以上で、濃度100ng/μLであれば、卵内で拡散せず、本物の核に酷似した形態を持つ核様構造になることが確認された。また、注入されたDNAの挙動はDNAの長さや濃度により異なることも判明。さらに、天然の核に酷似した核様構造を構築するためには、DNAを注入するタイミングが重要で、卵の細胞周期のうち、分裂終期を通過する条件に注入をすればよいことも解明された。

(上)マウス卵にDNAが注入されている様子。20秒経過しても細胞質で拡散せずにとどまった。(下)実験の流れ(出所:NEWSCAST Webサイト)

核輸送を行う核タンパク質の中に、ヌクレオソームに結合する「RCC1」がある。つまり、注入DNAが核輸送能力を獲得するためには、注入DNA上にヒストンタンパク質が集積し、ヌクレオソームの構造を形成する必要があるという。免疫染色法により確認が行われたところ、注入DNA上にヒストンタンパク質の集積が認められたとした。

注入DNA(黄色矢尻)上で、ヌクレオソームマーカーであるRCC1-EGFP(上段、緑色)とJF646-LANA(下段、緑色)が観察された(出所:NEWSCAST Webサイト)

次に、ヌクレオソームを形成していることの指標となるタンパク質である「RCC1-EGFP」について、ライブセルイメージングによる確認が行われた。さらに、別のヌクレオソーム結合プローブである「JF646-LANA」も用いての確認も実施された。その結果、注入DNA上でそれぞれのタンパク質のシグナルを検出することに成功。以上の結果から、マウス卵内への注入DNAは、ヌクレオソームを形成していることが確かめられた。

核輸送は、核膜上に多数点在する穴である「核膜孔複合体」を通じて行われる。つまり、注入DNAが核輸送能力を獲得するためには、核膜と核膜孔複合体を形成している必要がある。これらの構造の有無を確かめたところ、電子顕微鏡により、注入DNAの周囲に本物の核と酷似した核膜と核膜孔複合体が観察された。

卵の核と注入DNA由来の核様構造の核膜および核膜孔複合体構造の評価。注入DNA周囲に卵の核と酷似した構造が観察された。(a)電子顕微鏡像。黄色矢尻は核膜孔複合体。(b)核膜タンパク質と核膜孔複合体構成タンパク質の免疫染色像。(c)核膜孔複合体構成タンパク質のタイムラプス画像。黄色矢尻は注入DNA、青色矢印は卵の核(出所:NEWSCAST Webサイト)

さらに、核膜孔複合体を構成するタンパク質や核膜タンパク質が存在するのかどうかが、免疫染色により確認されると、注入DNAを取り囲むように、それらの存在が観察されたという。また、核膜孔複合体を構成するタンパク質がライブセルイメージングで観察された結果、DNA注入直後は認められなかったが、時間経過と共に観察され、注入DNAが核膜孔複合体を獲得する様子が捉えられたとした。

最後に、作製された人工細胞核が核輸送能力を有するのかどうかを確認するため、蛍光タンパク質を付加した核局在化シグナルが人工細胞核に入るかどうかが観察された。その結果、蛍光タンパク質が人工細胞核内に流入することが確認された。この蛍光タンパク質を取り込んだ人工細胞核に対して核輸送阻害剤が添加されたところ、蛍光タンパク質の流出が見られたという。さらに、核輸送に関与するタンパク質「Ran」が人工細胞核に存在していたことから、研究チームは、核輸送能力を有する人工細胞核を構築できたと結論づけたとした。

人工細胞核における核輸送能の評価。(上)核輸送マーカーであるsfGFP-EGFPを用いたタイムラプス画像。人工細胞核においてそのシグナルが観察され、核輸送阻害剤が加えられると消失した(二重矢尻)。(下)核輸送関連タンパク質であるRanの免疫染色画像。人工細胞核において、そのシグナルが観察された(出所:NEWSCAST Webサイト)