産総研、変性タンパク質の活性を回復させる有機ナノチューブゲルを開発

産業技術総合研究所(産総研) ナノチューブ応用研究センター 有機ナノチューブ材料チームの亀田直弘 研究員らは、変性したタンパク質を正常な立体構造へと折り畳ませて(リフォールディング)、本来の活性を回復させる有機ナノチューブゲルを開発した。この有機ナノチューブゲルはタンパク質を熱や化学物質から保護することができるという。同成果の詳細は2012年5月23日(日本時間)にアメリカ化学会の学術誌「ACS Nano」オンライン版に公開された。

生体内の化学反応を特異的かつ高収率・高選択に進行させる酵素が、化学工業分野における省エネルギー・環境低負荷型の触媒として、グリーンイノベーションの観点から注目を集めるようになってきた。酵素はタンパク質であり、構成成分であるアミノ酸の相互作用により、一定の立体構造に折り畳まれ、その形態に基づいて触媒機能を示す。タンパク質の調製には、大腸菌を用いた組み換え技術が工業的にも広く用いられている。

しかし、組み換えタンパク質の発現過程で、正常な立体構造から大きく変化し、触媒機能を失活した変性タンパク質の凝集体が生じてしまい、この凝集体から、正常な立体構造と本来の触媒機能を持ったタンパク質を回復させる効率は極めて低いため、凝集の抑制や正常な立体構造への折り畳み(リフォールディング)の補助をするさまざまな添加剤が開発されたが、収率や汎用性が低いという課題があった。

一方、生体系では、変性タンパク質を取り込んで隔離し、リフォールディングを補助するナノ空間をもつ分子シャペロンと呼ばれるタンパク質群があり、近年、分子シャペロンを模倣できる多孔質無機体や高分子ナノ粒子などが注目されるようになってきた。しかし、タンパク質の多孔質無機体や高分子ナノ粒子からの脱離には添加剤が必要であり、目的タンパク質には、添加剤やリフォールディングが不完全なタンパク質などが共存するため煩雑な分離操作が必要であり、分離操作によるタンパク質の再変性も懸念されている。

産総研では、過去10年以上にわたり、糖、アミノ酸、核酸、脂肪酸などの再生可能な天然由来物質から合成した両親媒性分子を液相中で自己組織化させて、ファイバ状の形態やチューブ状の形態(有機ナノチューブ)を持つ有機ナノ材料の開発に取り組んでいる。従来の二分子膜有機ナノチューブは、外側の表面と内側のナノチャンネル側の表面が同一の構造であるが、最近では分子設計や分子配列制御により、それぞれの表面の構造が異なっている単分子膜有機ナノチューブの構築にも成功している。ナノチャンネル側の表面を薬剤、タンパク質、DNA、ナノ粒子などのゲストと相互作用できる構造にすることで、効率的で選択的なゲストの包接や、相互作用を外部から制御することでゲストの貯蔵と放出を制御できるという特長がある。今回の研究は、変性タンパク質をゲストとするように、表面の構造やナノチャンネルの径を精密に制御した有機ナノチューブゲルを構築し、タンパク質のリフォールディング促進や活性保護など新たな機能開拓を目指して行われた。

疎水性の部分が表面に露出した変性タンパク質は、水溶液中で凝集が起こりやすいため、変性タンパク質を有機ナノチューブ内に効率よく包接し、凝集を抑制することを目的にナノチャンネル側表面に疎水性の構造を導入した。図2のような両親媒性分子1と末端に疎水性のベンジル基(図2aの緑色部分)を有する誘導体を設計・合成し、この2つの成分を自己組織化させることで、両親媒性分子1と誘導体のモル比が9:1の有機ナノチューブゲル(L-10-NTG)を形成した。

有機ナノチューブゲルの形成は、室温下で水酸化ナトリウムによりpHを調節することで行った。なお、有機ナノチューブは両親媒性分子1と誘導体が平行配列した単分子膜からなり、内径は10nmであった。また、比較のために両親媒性分子1だけの自己組織化により、有機ナノチューブゲル(H-10-NTG)を、また、両親媒性分子2だけの自己組織化により有機ナノチューブゲル(H-20-NTG、有機ナノチューブの内径は20nm)を調製した。

モデルタンパク質として緑色蛍光タンパク質(GFP、分子量約3万)を用い、塩酸グアニジン(GdmCl、濃度6M)によって化学変性させた後、L-10-NTGとH-10-NTGの自己組織化の際に変性GFPを共存させて、有機ナノチューブゲルの形成と同時に変性GFPをナノチャンネルに包接させた。5mgのL-10-NTGに包接された変性GFP量は38μgで、H-10-NTGによる包接量(13μg)よりも約3倍多かった。これはL-10-NTG内部のベンジル基と変性GFP疎水性部分との疎水性相互作用によると考えられるという。

変性剤GdmClの濃度を1mM以下にするため、変性GFPを包接した有機ナノチューブゲルを水で洗浄したところ、包接されたGFPの一部が蛍光活性を回復し、ナノチャンネルにおいてリフォールディングが促進されていた。

さらに回収溶液(pH 7.8のバッファ溶液)を添加すると、両親媒性分子1のナノチャンネル側表面にあるグリシンアミノ基が無電荷状態となってGFPとの静電相互作用が消失する。そのため、ナノチャンネルでのリフォールディングによりすでに正常構造となったGFPだけでなく、ナノチャンネルでリフォールディングが不完全だったGFPもリフォールディングした状態で、有機ナノチューブゲルから回収することができることが確認された。

包接したGFPの全リフォールディング率は、H-10-NTGで49%、L-10-NTGで85%であり、ナノチャンネルへの疎水性構造(ベンジル基)の導入により、特に放出・回収時のリフォールディングが強く誘起されていた。リフォールディングしなかった変性GFP(H-10-NTGで51%、L-10-NTGで15%)は有機ナノチューブゲルに包接されたままであり、特別な添加剤を使わなくてもリフォールディングしたGFPだけをpHを調節した回収溶液に選択的に回収できた。従来の希釈法によるGFPのリフォールディング率は14%であり、有機ナノチューブゲルによりリフォールディングが促進されることが明らかとなった。

H-10-NTGは、GFPと同程度の分子量である炭酸脱水素酵素(CAB、分子量約3万)に対してはリフォールディング促進機能を示したが、分子量がより大きなクエン酸合成酵素(CS、分子量約10万)のリフォールディングを効率的に誘起できなかった。一方、有機ナノチューブの内径が20nmであるH-20-NTGは、CSに対して高いリフォールディング促進機能を示すものの、GFPとCABのリフォールディングはまったく誘起できず、むしろ内部のナノチャンネルでそれらのタンパク質の凝集が促進された。これらから、個々のタンパク質に対して適切な内径サイズを持つ有機ナノチューブゲルが高いリフォールディング促進機能を持つことが判明した。

有機ナノチューブゲルは、リフォールディング促進機能のほかにタンパク質の熱変性や化学変性を強く抑制する保護機能を持っている。水中のフリーのCABは、加熱や高濃度の尿素(変性剤)によって熱変性や化学変性により酵素活性をほぼ完全に失うが、L-10-NTGのナノチャンネル内部に包接されたCABは、加熱や変性剤から保護され、同条件でも、90%近くの酵素活性を保持していることが確認された。

研究チームでは今後、物性が異なる種々のタンパク質に対して、表面構造やナノチャンネルの径を適切に制御した有機ナノチューブゲル群を創製し、サンプル提供を含む共同研究によって人工分子シャペロンシステムの確立を目指すとしている。また、酵素複合化有機ナノチューブのナノリアクターや酵素センサへの応用展開も行っていく予定としている。