理化孊研究所(理研)は、間違った神経回路の圢成を阻害する反発性軞玢誘導因子による成長円錐の退瞮が、今たで考えられおきたメカニズムずはたったく異なる、「マクロピノサむトヌシス」ず呌ぶ倧きな现胞膜の回収によっお制埡されおいるこずを明らかにした。

これは、理研 脳科孊総合研究センタヌ 発生神経生物研究チヌムの埡子柎克圊チヌムリヌダヌ、暺山博之研究員らによる共同研究の成果で、同成果の詳现は米囜科孊雑誌「The Journal of Neurescience」に掲茉された。

神経回路の圢成は、誘因性軞玢誘導因子ず反発性軞玢誘導因子の組み合わせによっお成り立っおいる。その内、反発性軞玢誘導因子は、神経突起先端にある成長円錐の退瞮を匕き起こすこずで神経突起の䌞長を止め、間違った神経现胞ずのシナプス圢成を阻害する。この成長円錐の退瞮は、正垞な神経回路圢成のために重芁な圹割を担っおおり、䟋えば、反発性軞玢誘導分子の1぀であるSema3Aを欠損したマりスは、初期発生期の神経突起が間違った方向ぞ䌞び続け、神経回路網が正垞に圢成されない。たた、Sema3Aは脊髄損傷時にその発珟が誘導され、神経再生を阻害するこずが分かっおいる。このため、脊髄損傷治療の面からも、この反発性軞玢誘導因子による成長円錐の退瞮の仕組みを解明するこずは重芁ずされおいるが、これたで、成長円錐の退瞮時の膜衚面積の枛少の制埡にかかわる分子機構の実䜓は䞍明のたたであった。

ニワトリ背根神経節神経现胞の神経突起の先端にある成長円錐

现胞膜を回収するシステムずしお゚ンドサむトヌシスが知られおいる。2008幎に研究グルヌプは、Sema3Aにより成長円錐でマクロピノサむトヌシスが誘導されるこずを報告しおいる。マクロピノサむトヌシスの特長ずしお、クラスリン非䟝存性の现胞膜回収の゚ンドサむトヌシスであるこず、蛍光ラベルされた分子量10䞇以䞊のデキストランを取り蟌むこずで可芖化できるこず、取り蟌たれた小胞は倧きいため、空胞(Vachole)ずも呌ばれ、顕埮鏡䞋でしばしば容易に芳察できるこず、があげられ、近幎マクロピノサむトヌシスはあらゆる生呜珟象に深く関わるこずが瀺されおいる。

2008幎の成果は、神経现胞でマクロピノサむトヌシスが誘導されるこずを瀺したものであったが、Sema3A誘導のマクロピノサむトヌシスの生理的圹割や分子機構は解明されおいなかった。

Sema3Aによっお取り蟌たれた空胞面積は、成長円錐の衚面積ず逆盞関し、成長円錐の退瞮ずずもに空胞は増えおいくこずから、今回、研究グルヌプでは、マクロピノサむトヌシスが成長円錐の退瞮に重芁な圹割を担っおいるず考え、マクロピノサむトヌシスを特異的に阻害するEIPAを甚いお解明を行った。

ニワトリの培逊背根神経節の神経现胞の成長円錐は、Sema3Aにより退瞮するが、EIPAの存圚䞋では、Sema3Aによる成長円錐の退瞮は抑制され、デキストランの取り蟌みも同様に抑制された。この結果は、Sema3Aによる成長円錐の退瞮が、マクロピノサむトヌシスによる现胞膜の倧芏暡な回収によるものであるこずを瀺しおいるずいう。

EIPA存圚䞋ではSema3Aによるデキストランの取り蟌みず成長円錐の退瞮が抑制される。

AD:ニワトリ胚背根神経節神経现胞の成長円錐の固定暙本。通垞成長円錐は手の平のような圢で(A)、デキストランの取り蟌みも芳察されない(C)。Sema3A添加により、デキストランの取り蟌み(青矢頭、D)、ず成長円錐の退瞮(B)が起きる。図Dの挿入図はデキストラン(マれンタ)ず埮分干枉像を重ねたもの。デキストランが退瞮した成長円錐に取り蟌たれおいる。

EH:マクロピノサむトヌシス阻害剀EIPA存圚䞋における成長円錐。Sema3A添加を行っおも、デキストランの取り蟌みや成長円錐の退瞮は起こらない。

I:デキストランを取り蟌んだ成長円錐の割合(%)。通垞Sema3A凊理をするず成長円錐のデキストラン陜性率は察照(牛血枅アルブミン)凊理ず比べ、有為に䞊昇する。しかしEIPA存圚䞋では、Sema3A凊理を行っおも、デキストラン陜性率は増加しない。これはSema3Aによるデキストランの取り蟌みがマクロピノサむトヌシスを介しおいるこずを瀺しおいる。

J:成長円錐面積。Sema3A凊理によっお、成長円錐の面積は枛少する(退瞮)。しかしEIPA存圚䞋では、Sema3A凊理による成長円錐の面積の枛少は抑制される。これはSema3Aによる成長円錐の退瞮がマクロピノサむトヌシスによるものであるこずを瀺しおいる。

なお、図䞭の**は、統蚈的に差が有意であるこずを瀺すもの

次に研究グルヌプは、成長円錐でマクロピノサむトヌシスがどのように誘導されるかを調べるため、マクロピノサむトヌシスを成長円錐で制埡する分子の同定を詊みた。たず、膜茞送分子であるSyntaxin1Bを切断する掻性を持぀ボツリヌフ毒玠(Neurotoxin C1)に着目。Neurotoxin C1は成長円錐を退瞮させるず同時に、空胞圢成を誘導するこずが知られおおり、その空胞がマクロピノサむトヌシスによる空胞ずよく䌌おいるこずから、研究グルヌプはNeurotoxin C1による空胞圢成がマクロピノサむトヌシスによるものず掚枬し、解析を行った。この結果、デキストランがNeurotoxin C1による空胞に取り蟌たれるこずが刀明した。

成長円錐におけるマクロピノサむトヌシス制埡分子の探玢。

AC:Neurotoxin C1(NT-C1)凊理したニワトリ胚背根神経節神経现胞の成長円錐のラむブむメヌゞング。空胞にデキストランが取り蟌たれおいる。

DF:察照の成長円錐。空胞圢成やデキストランの取り蟌みは芳察されない。

G:デキストラン陜性成長円錐の割合。NT-C1凊理により、デキストラン陜性成長円錐が有為に増加する。EIPA存圚䞋ではNT-C1凊理を行っおもデキストラン陜性成長円錐の割合は増加しない。

H:成長円錐面積。NT-C1凊理により、成長円錐の面積が枛少するが、EIPA存圚䞋では、NT-C1凊理による成長円錐の面積の枛少は抑制される。これはNT-C1凊理による成長円錐の退瞮がマクロピノサむトヌシスを介しおいるこずを瀺す。

なお、**、***は、統蚈的に差が有意であるこずを瀺しおいる。*の数が倚いほど有為である

たた、Neurotoxin C1によるデキストランの取り蟌みず成長円錐の退瞮は、EIPAにより抑制されおおり、これらの結果は、Neurotoxin C1による空胞圢成ず成長円錐の退瞮がマクロピノサむトヌシスによるものであるこずを瀺したずする。

Neurotoxin C1は、成長円錐に局圚するSyntaxin1Bを切断するこずで、空胞圢成を誘導するこずが知られおいる。そのため、Syntaxin1Bの発珟を枛少させるこずで同様に、成長円錐の退瞮ずマクロピノサむトヌシスの誘導が起きるか調べたずころ、実際にそれらの珟象を芳察するこずができた。

Syntaxin1Bはマクロピノサむトヌシスの負の制埡因子

A:Syntaxin1Bの発珟を抑制するsiRNA(Syx1B-siRNA)を導入した背根神経節神経现胞におけるSyntaxin1Bの発珟抑制の様子。察照ず比べ、Syntaxin1Bの発珟が玄53.4%たで䜎䞋する。

BG:成長円錐の固定暙本。蛍光タンパクEGFPを共導入し、siRNAが導入した成長円錐を可芖化したもの。Syx1B-siRNAを導入した成長円錐はデキストランの取り蟌みず退瞮が芳察できる(B、C)。察照のsiRNAを導入した成長円錐ではデキストランの取り蟌みも退瞮も芳察できない(D、E)。EIPA存圚䞋では、Syx1B-siRNAによるデキストランの取り蟌みず成長円錐の退瞮は抑制される(F、G)。

H:デキストラン陜性成長円錐の割合(%)。B-Gで瀺した成長円錐のデキストラン陜性率を解析した。

I:B-Gで瀺した成長円錐の面積。

なお、**、***は、統蚈的に差が有意であるこずを瀺しおいる。*の数が倚いほど有為である

これは、Syntaxin1Bはマクロピノサむトヌシスの負の制埡因子であるずずもに、マクロピノサむトヌシスが成長円錐を退瞮させるこずを瀺しおいる。

Syntaxin1Bの枛少により誘導される成長円錐の退瞮ずマクロピノサむトヌシスは、Sema3Aによるものず酷䌌しおいるため、Sema3AがSyntaxin1Bの機胜や発珟を䜎䞋させおいる可胜性が考えられ、成長円錐のSyntaxin1Bのタンパク量は10分間のSema3A凊理により、枛少するこずが刀明した。

Sema3Aにより、成長円錐におけるSyntaxin1Bのタンパク量が枛少する

AD:察照たたはSema3A凊理した成長円錐の免疫染色像。Syntaxin1B抗䜓ずSNAP25抗䜓で二重染色した。

E:成長円錐におけるSyntaxin1Bタンパク量の定量化。SNAP25タンパク量でSyntaxin1Bタンパク量を暙準化し比范した。Sema3A凊理によっお、有為にSyntaxin1Bタンパク質は枛少する。

F:反発性軞玢誘導因子のephrin A2によっおも、SEMA3Aず同様に、成長円錐においおSyntaxin1Bタンパク量が䜎䞋する。

G:擬䌌的に成長円錐の圢態を退瞮させるアクチン繊維の脱重合阻害剀(Jas)はSyntaxin1Bタンパク量を䜎䞋させない。

なお、***は、統蚈的に差が有意であるこずを瀺しおいる

このようなSyntaxin1Bの枛少は、ほかの反発性軞玢誘導分子ephrin-A2でも芳察できるが、アクチン繊維の脱重合を阻害する薬剀では芳察できなかった。これは、Sema3AががSyntaxin1Bの発珟を抑制するこずによっお、マクロピノサむトヌシスを誘導するこずを瀺しおいる。

逆にSyntaxin1Bを過剰発珟させるず、Sema3Aによる成長円錐の退瞮ずマクロピノサむトヌシス誘導が抑制されるこずが分かった。

Syntaxin1B過剰発珟はSema3Aによる成長円錐の退瞮を抑制する

AD:EGFPたたはEGFP-Syntaxin1B(EGFP-Syx1B)を過剰発珟した成長円錐の固定暙本。EGFP-Syx1Bを過剰発珟した成長円錐ではSema3A凊理による成長円錐の退瞮(A、B)やデキストランの取り蟌み(C、D)を抑制する。

EH:EGFPを発珟した成長円錐ではSema3A凊理によっお成長円錐の察瞮(E、F)やデキストランの取り蟌み(G、H)が芳察される。図Hの挿入図はデキストラン(Hのマれンタ郚分)ずFの重ね合わせた画像。退瞮した成長円錐にデキストランが取り蟌たれた。

I:デキストラン陜性成長円錐の割合。Sema3A凊理により、デキストラン陜性成長円錐が有為に増加する。EGFP-Syx1Bを過剰発珟するず、Sema3A凊理を行っおもデキストラン陜性成長円錐の割合は増加しない。

J:培逊ディッシュ䞭の成長円錐面積。Sema3A凊理により、成長円錐の面積が枛少する。

EGFP-Syx1Bの過剰発珟は、Sema3A凊理による成長円錐の面積の枛少を抑制する。これはSema3A凊理による成長円錐の退瞮がマクロピノサむトヌシスを介しおいるこずを瀺す。

なお、**、***は、統蚈的に差が有意であるこずを瀺し、*の数が倚いほど有意差がある

これによりSema3AがSyntaxin1Bの発珟を枛少させるこずでマクロピノサむトヌシスを誘導し、その結果、成長円錐を退瞮させおいるこずが明らかずなった。

これたでの研究では、成長円錐の退瞮を決めるのはアクチンなどの骚栌系タンパク質ず考えられおきた。それに察し今回の研究では、成長円錐の退瞮に「マクロピノサむトヌシスによる倧芏暡な现胞膜の回収」ずいう新たな分子機構が働いおいるこずを提唱するものずなる。Sema3Aは発生初期の神経回路網圢成に重芁であり、たた、神経再生が困難な脊髄損傷においお、䞭枢神経系の神経再生を阻害する分子ずしおも知られおいるこずから、今回の成果により、Sema3Aがマクロピノサむトヌシスにより成長円錐を退瞮させおいる可胜性が瀺されたこずに、倧きな意矩があるず研究グルヌプでは説明しおいる。

Syntaxin1B過剰発珟はSema3Aによる成長円錐の退瞮を抑制する

AD:EGFPたたはEGFP-Syntaxin1Bを過剰発珟した成長円錐の固定暙本。EGFP-Syx1Bを過剰発珟した成長円錐ではSema3A凊理による成長円錐の退瞮(A、B)やデキストランの取り蟌み(C、D)を抑制する。

EH:EGFPを発珟した成長円錐ではSema3A凊理によっお成長円錐の察瞮(E、F)やデキストランの取り蟌み(G、H)が芳察される。図Hの挿入図はデキストラン(Hのマれンタ郚分)ずFの重ね合わせた画像。退瞮した成長円錐にデキストランが取り蟌たれた。

I:デキストラン陜性成長円錐の割合。Sema3A凊理により、デキストラン陜性成長円錐が有為に増加する。EGFP-Syx1Bを過剰発珟するず、Sema3A凊理を行っおもデキストラン陜性成長円錐の割合は増加しない。

J:培逊ディッシュ䞭の成長円錐面積。Sema3A凊理により、成長円錐の面積が枛少する。

EGFP-Syx1Bを過剰発珟は、Sema3A凊理による成長円錐の面積の枛少を抑制する。これはSema3A凊理による成長円錐の退瞮がマクロピノサむトヌシスを介しおいるこずを瀺す。

なお、**、***は、統蚈的に差が有意であるこずを瀺し、*の数が倚いほど有意差がある

なお、今埌は、Sema3Aに䟝存的なマクロピノサむトヌシスの分子機構をさらに詳しく解明しおいくこずで、神経再生法の確立にも぀ながっおいくものずの期埅を研究グルヌプでは瀺しおいる。