岡山大、ビタミンB12関与酵素の「再活性化分子シャペロン」の仕組みを解明

岡山大学は1月27日、ビタミンB₁₂関与酵素の再活性化「シャペロン」である「ジオールデヒドラターゼ(DD)再活性化酵素(DD-R)」の「ヌクレオチドスイッチ」と「サブユニットスワッピング」に関与するアミノ酸残基を同定したと発表した。

成果は、岡山大の虎谷哲夫 名誉教授、同・大学院 自然科学研究科の森光一助教らの研究チームによるもの。研究の詳細な内容は、2013年12月3日付けで米生物化学系国際雑誌「Biochemistry」に掲載された。

虎谷名誉教授らがかつて発見したのが、ビタミンB₁₂が補酵素として関与する酵素(以下、B₁₂酵素)の触媒機構を詳細に研究する過程で、不活性化されたB₁₂酵素を再活性化する3種類の「分子シャペロン」と呼ばれるタンパク質だ。「再活性化因子」または「再活性化酵素」と名付けられた。

シャペロンとは日本人からするとちょっと馴染みのない単語だが、「若い貴婦人が社交界にデビューするときの介添え役」というのが元々の意味で、それが転じて分子の世界で「タンパク質が正しく折り畳まれて立体構造を形成するのを助けるタンパク質」のことを分子シャペロン、または単にシャペロンとしたのである。今回の研究は、その中で最も研究が進んでいるDD-Rが用いられ、不活性化されたB₁₂酵素の再活性化の分子機構が明らかにしたという内容だ。

ビタミンB₁₂はコバルトを含む「錯体」(金属と非金属の原子が結合した構造の化合物)で、生体内で補酵素型(ビタミンB₁₂補酵素:画像1)に変換され、酵素の活性部位に結合してその触媒作用を助ける。ビタミンB₁₂補酵素はコバルト-炭素(Co-C)結合を含む複雑な構造と重要な生理機能により、理、工、農、薬、医など多くの分野の研究者らを魅了してきた。

B₁₂酵素は、化学的に起こり難い反応を触媒するため、「ラジカル」という超活性種を活用している(画像2)。ラジカルは不対電子を持つ化学種のことで、一般に反応性がきわめて高い反面、副反応を起こして消滅し易く、その結果補酵素が損傷を受けてしまう。その損傷補酵素は酵素から離れないため、B₁₂酵素は不活性化され易いという宿命があるのだ。

画像2は、触媒機構と補酵素リサイクリングの概略。B₁₂補酵素(アデノシルコバラミン:AdoCbl)が関与する酵素はラジカル機構で触媒する(基質はSH、生成物はPH)。ラジカル中間体のいずれかが副反応を起こしてラジカルが消滅すると、補酵素が再生されず、生じた損傷補酵素(X-Cbl)が酵素から離れないため酵素は不活性化される。

そして再活性化酵素として働くシャペロンはATP存在下で、強固に結合しているX-Cblを酵素から解離させる。生じたアポ酵素(E)はAdoCblと結合して活性な「ホロ酵素」を再構成する。X-Cblは「コバラミン還元酵素」と「アデノシル基転移酵素」によりAdoCblに再生されるという具合だ。

そうしたB₁₂酵素とヌクレオチド依存的に固く結合して損傷補酵素を解離させることで、B₁₂酵素を再活性化するという作用機構を持っていたのが、再活性化シャペロンである。さらに再活性化シャペロンの立体構造が解析され(画像3)、類似した構造のサブユニットを持つ酵素との間でサブユニットスワッピング(2つのタンパク質の間でサブユニットの交換が起こること)により複合体が生成されること、およびこの複合体中で誘起される立体反発により損傷補酵素が解離するという機構が明らかにされた。

しかし、ヌクレオチド依存的に酵素との結合性が変化し、シャペロン機能が発現するというヌクレオチドスイッチとサブユニットスワッピングに関与するアミノ酸残基については不明のままだった。

そこで研究チームは今回、3種類のB₁₂酵素再活性化シャペロンと熱ショックタンパク質「Hsp70」が全体的には似ていないものの、アミノ酸配列が局所的に類似した領域が3カ所存在し、それらが「ADP」結合部位の3つのループに対応することをDD-RのX線構造解析により解明したのである(画像4)。

さらに研究チームは今回、これらの局所的類似領域のアミノ酸残基に変異を導入して研究を進めた。その結果、いずれのループもDD-Rの機能に必須であることがわかり、ATPの加水分解に重要なAsp残基とATP-ADPスイッチに重要なAsp残基とを同定することにも成功したというわけだ(画像5)。また、DD-Rのサブユニット界面に存在するMg²⁺の役割に着目し(画像6)、Mg²⁺に配位している残基に変異を挿入するとDD-R機能が失われることが示された。

さらに、このMg²⁺に配位するGlu残基を含む(Glu)3クラスター領域がB₁₂酵素DD側にも存在することに注目し(画像3)、真ん中のGluをGln残基で置換すると、DDがDD-Rによる再活性化を受けられなくなることも確認されたのである。これらの研究成果により、DD-Rのヌクレオチドスイッチ機構の一端が解明され、また、Mg²⁺への配位がサブユニットスワッピングとDDの再活性化に不可欠であることが明らかとなったというわけだ。

今後、非加水分解性ATPアナログが結合したDD-Rの立体構造を解明することで、B₁₂酵素再活性化シャペロンのヌクレオチドスイッチの精密な機構が解明されると期待されるとしている。