京都大学は2月13日、広島大学と共同研究で、人工酵素「TALエフェクターヌクレアーゼ(Transcription Activator-Like Effector Nuclease:TALEN)」を作製し、それ用いたノックアウトラットを作製したほか、DNA鎖の「5'末端」から分解する酵素「エキソヌクレアーゼ(Exo1)」をTALENと一緒にラット受精卵に導入することで、遺伝子改変効率を約5倍高めることに成功したと発表した。

成果は、京大 医学研究科 附属動物実験施設の真下知士 特定准教授、同・金子武人 特定講師、広島大学の山本卓 教授らの研究グループによるもの。研究の詳細な内容は、2月13日付けで英国オンライン総合学術誌「Scientific Reports」に掲載された。

遺伝子を破壊(ノックアウト)した動物を活用することで、遺伝子の機能の解析が進められている。研究グループでもこれまでに、人工ヌクレアーゼ(核分解酵素)をラット受精卵に導入することにより、「Il2rg」や「Prkdc」といった遺伝子をノックアウトした免疫不全ラットを作製する遺伝子改変技術「ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)」の開発に成功している。このZFN技術は現在、従来のES細胞を用いた遺伝子改変技術に比べて、短期間で、効率的に、さまざまな動物種(系統)に利用できる技術として注目されるようになってきたが、ZFN自体を研究者自身が作製することが難しく、多くの場合、業者から購入している状況だという。

こうした課題を解決する遺伝子改変技術として近年、「TALEN」に注目が集まってきているという。TALENは植物の病原細菌である「Xanthomonas(キサントモナス)」から発見されたDNA結合タンパク質「TALE」と、DNA切断ドメイン「FokI」を融合させた人工酵素であり、短期間でTALENプラスミドが作製できる点、標的DNA配列を自由に変更できる点など、ZFNよりも利便性の高い技術といわれている。

そこで研究グループは今回、ラット遺伝子を標的としたTALENを研究室で作製し、そのTALENをラット受精卵に導入することにより、ノックアウトラットの作製を行ったという。

具体的には、最初にメラニン色素の合成に関わる遺伝子で、動物では遺伝子が変異あるいは欠損すると体毛や皮膚が白くなる「色素欠乏症(アルビノ)」になる「ラットチロシナーゼ(Tyr)」を標的とするTALENプラスミドを作製した。

画像1。Tyrを標的としたTALEN

次に、ラット線維芽細胞「Rat-1」に作製したTALENプラスミドを「エレクトロポレーション法」にて導入することで、同細胞内のTyr遺伝子に数～数10bpの遺伝子変異を導入することに成功したという。

画像2(左)の(A)は、Rat-1とGFPを導入したRat-1細胞。(B)はSurveyor(Cel-1)ヌクレアーゼアッセイ法により確認された遺伝子変異。エキソヌクレアーゼ(Exo1)共発現により遺伝子変異導入率が上昇。画像3の(C)と(D)は、シークエンス法により確認された遺伝子変異

さらにラット受精卵にTALENとExo1メッセンジャーRNAを「マイクロインジェクション」により導入し、2細胞期胚からDNAを抽出したところ、遺伝子変異の導入率がTALEN単独の場合の5.6%と比べて、28.6%まで上昇することが確認されたという。

左がラット受精卵へマイクロインジェクション法によりTALENを導入(画像4)、右がSurveyorアッセイにより確認された遺伝子変異(画像5)

そして最後にTALENとExo1をラット受精卵を共導入することで、Tyr遺伝子ノックアウトラット(アルビノ)が効率的に作製できることが示されたとしている。

画像6(左)は、ラットTyr遺伝子を欠損して全身が真白になったアルビノラット(Tyrノックアウトラット)。画像7(右)はその遺伝子変異

なお研究グループでは今回開発された技術は、マウスやラット、そのほかのさまざまな動植物に利用することが可能であるため、今後、同技術を活用することで多数の遺伝子改変動物が作製されるようになり、その結果、先進的医学研究・創薬研究・再生医療研究などが発展することが期待できるとコメントしている。